I.INTRODUCCIÓN

Los telómeros forman una parte fundamental para el desarrollo de la vida y el envejecimiento [1-3]. Existe evi- dencia que indica que en ciertos casos los telómeros son disfuncionales, como resultado de su acortamiento crítico en las células somáticas normales, lo cual provoca una respuesta al daño a nivel de ácido desoxirribonucleico ADN

[4].En las células tumorales, la telomerasa confiriere la inmortalidad celular y también regula la generación de ácido ribonucleico mensaje ARNm. Estas características reflejan que la telomerasa relacionada con la aparición de tumores malignos y su difusión en diferentes órganos [5]. Algunos estudios sugieren que la estabilización del cuar- teto G telomérico (G4), puede inhibir directamente la acción de la telomerasa mediante el bloqueo de la unión de la telomerasa al telómero [6]. Una gran variedad de estructuras G4 se han dilucidado a nivel atómico, generando una nueva vía para el diseño de ligandos dirigidos hacia la estructura del G4 de forma computacional [7]. Los últimos estudios realizados sobre estabilizadores de G4 mencionan que la interacción entre G4 y el ligando ejerce efectos antiproliferativos a través de mecanismos dependientes e independientes de los telómeros. No obstante, hasta el momento encontrar compuestos que estabilicen G4 ha resultado en un gran desafío. A pesar de que existen muchos datos disponibles sobre G4 y sus ligandos, solo un número limitado, se ha explorado para la detección virtual o en la detección de nuevas moléculas bioactivas. Aunque en la actualidad se usen múltiples técnicas para el descu- brimiento de fármacos asistido por herramientas virtuales, existe una clara falta de comprensión en el mecanismo molecular primario que se encuentra tras la actividad de los aciertos que se consigue empleando estas técnicas [9]. Por otra parte, para la validación de los resultados requiere la combinación de distintos métodos o herramientas para superar las falencias que presenta un único protocolo, lo cual puede hacer que proceso se considere más com- plejo [10].

A partir de esto, se ha planteado desarrollar una metodología de cribado virtual basada en estructura y como estrategia para la validación de datos se usara un algoritmo genético. La estructura de este trabajo inicia con los aspectos teóricos del tema en el apartado III, seguido de la metodología y programas aplicados en la sección III, a continuación se detallan los resultados obtenidos y se tiene como punto final las conclusiones.

II.DESARROLLO

A)Características de los telómeros y la telomerasa

En los mamíferos los extremos de los cromosomas se encuentran cubiertos por estructuras protectoras de ADN y proteínas de unión. A este complejo se le denomina telómero [11]. Los telómeros son estructuras conformadas de nucleoproteínas situadas en el extremo de cada brazo cromosómico. Cumple como principal función el manteni- miento de la estabilidad del genoma, al garantizar que los extremos naturales de los cromosomas no se confundan con sitios de daño en el ADN [12]. Además de presentar un papel fundamental frente a la señalización del daño del ADN, también evitan su reparación errónea. Esta función de activar la respuesta al daño e inhibir su reparación, podría tener una consecuencia importante en el proceso de envejecimiento celular dependiente de la longitud telo- mérica y la supresión tumoral [13].

La telomerasa es un heterodímero de transcriptasa inversa, formada por una subunidad enzimática y una catalítica de molde de ARN no codificante, para la síntesis de novo de secuencias de ADN no telomérico. Los componentes principales de la telomerasa son la transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT) y el componente de ARN de la telomerasa (TERC). El molde de ARN, permite que TERT agregue repeticiones al terminal cromosó- mico. TERC se caracteriza por expresarse de forma constante, a diferencia de TERT que permanece inactiva en las células somáticas, generando el acortamiento constante en los telómeros [13]. La represión de la telomerasa en las células somáticas y el mecanismo de barrera de proliferación de los telómeros, generan una vía supresora que limita el crecimiento de las células tumorales [14]. Según resultados estadísticos, el 85% de células cancerígenas usan la telomerasa para mantener la longitud del telómero. En tumores que presentan un estado avanzado o metástasico, la actividad de esta ribonucleoproteína se ve incrementada. La telomerasa confiere inmortalidad a las células can- cerígenas, adicionando repeticiones en tándem al extremo 3' del telómero, dando como consecuencia un manteni- miento o prolongación sobre la longitud del telómero [15].

B)Definición y características del G4 telomérico

Las estructuras de ácido nucleico helicoidal de cuatro cadenas ricas en guanina reciben el nombre de G- cuádru- plex o G4 [16]. Esta estructura es definida como una forma alternativa de ADN o ARN compuesta por varias capas

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planas de guaninas denominadas tétradas, se forman por lo general por secuencias de tipo 5’-G3+N1-7G3+N1- 7G3+N1-7G3+-3’, donde N puede representar cualquier base nitrogenada (purinas y pirimidinas). El G4 se forma al ensamblarse las tétradas de guanina, de forma apilada hasta adaptar un bucle con interacciones que se consideren energéticamente favorables [16]. Estas se unen por enlaces de hidrogeno de tipo Hoogsteen, en donde cada tétrada rota aproximadamente 90° respecto a la adyacente. Para conseguir un buen ensamblaje es necesaria la presencia de cationes, con el fin de que se unan entre cada par de tétradas, coordinadas por los grupos carbonilo. La presencia de los cationes suele ser coordinada por las secuencias que conforman el bucle que brinda la estructura a G4 [17]. Los bucles que conectan cada tétrada en la topología paralela son de doble cadena conformados por pocos nucleótidos, mientras que en las formas antiparalela e hibrida su longitud se extiende con un mayor número de nucleótidos [18].

C)Detección virtual de ligandos para G4

Hasta el momento existen más de 1.000 ligandos caracterizados, que ejercen efecto estabilizador sobre G4. Su descubrimiento ha partido de herramientas computacionales como cribado virtual (VS) y cribado tradicional de alto rendimiento (HTS) [17-18]. Estos ligandos se pueden dividir en dos clases químicas: compuestos heteroaro- máticos planos y ligandos cíclicos o alicíclicos. Algunas de estas moléculas han sido cristalizadas con G4 y han sido usados para generar nuevos modelos de investigación [19]. Los métodos computaciones para encontrar nuevos estabilizadores son varios. Entre los más usados está el farmacóforo, un modelado basado en características especí- ficas para garantizar las interacciones con un objetivo biológico definido y desencadenar su respuesta biológica. En conclusión este método se basa en unión del ligando a su objetivo [18]. Otra estrategia consiste en el modelamiento basado en formas. Se base en la estructura o geometría del compuesto para que este sea complementario al estar ac- tivo. Cuando la estructura de la molécula esta activa sirve como plantilla o molde para la generación de un modelo de forma. Para obtener mejores resultados usando esta estrategia se sugiere que se adicione información química. La característica común de estas dos estrategias es que filtran una gran cantidad de compuestos de bases de datos, pues es uno de los requisitos de ambos modelos. Por otra parte, las estrategias de acoplamiento o docking requie- ren específicamente datos estructurales del target. La eficiencia del método se estima mediante el cálculo de energía libre [15]. La combinación de múltiples métodos mejora el enriquecimiento de las moléculas activas en los resulta- dos virtuales, además, ayuda a solucionar el problema de selectividad que suelen tener este tipo interacciones [14].

D)Métricas de enriquecimiento

Para el rendimiento del modelo se debo tomar en cuenta: área bajo la curva acumulativa (AUAC), Factor de enriquecimiento (EF) y discriminación de ROC mejorada por Boltzmann (BEDROC) [14].

𝑖𝑖=1

La ecuación 1, permite determinar la curva AUAC, en donde N es el número total de compuestos, n la cantidad de compuestos activos y Xi el ranking relativo del compuesto i.

La métrica EF calcula el número de veces que se enriquece una fracción con compuestos activos en relación con lo que se espera de una distribución uniforme de activos.

En la ecuación 2 se muestra la métrica EF, donde ri es la clasificación relativa de Xi= ri/N en toda la lista clasifi- cada; X es la fracción de la lista ordenada ponderada entre 0 a 1.

La ecuación 3 muestra el cálculo para BEDROC considerando un valor de α=160,9. Mientras que las ecuaciones 4 refleja cómo obtener BEDROC

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III.METODOLOGÍA

Como punto inicial se buscó del banco de datos de proteínas RCSB PDB las estructuras de tipo paralela, anti paralela e hibrida del G4 telomérico [15]. A partir de la estructura se eligió como receptor la molécula con la molé- cula de acridina 3, 6,9 –trisustituida BRACO19 (3CE5). Para su preparación se usó de los paquetes de OEDocking el Software MakeReceptor [16]. En el proceso de preparación se eliminaron las moléculas de agua y el ligando. Además se agregaron átomos de hidrogeno y cargas. Para la Preparación del ligando Para generar las conformacio- nes 3D se empleó el software OMEGA. Se aprovecharon las herramientas MakeFraglib para la generación de frag- mentos, Omega 2 para construcción 3D de los fragmentos guardando un total de 200 conformaciones [17]. Mien- tras que con el Software Quacpac se aplicó molcharge para adicionaron las cargas a las estructuras 3D [18]. Luego de obtenerse el ligando con un máximo de 200 conformaciones 3D mas las cargas y haber preparado el receptor, se realizó el acoplamiento con el software FRED [19]. Se puntuaron con Chemgauss4 500 moléculas para evaluar la calidad de las poses. Se guardaron aquellas con la puntuación más baja para cada conformación de ligando, dando un máximo de 20 poses. Para encontrar estabilizadoress de G4 Se usó la base de datos G4LDB [20] y se buscaron compuestos en base a la estabilidad de FRET mayor a 10 grados y menor a 10 grados. De la información que se recopiló se filtró considerando la secuencia del telómero humano y las concentraciones experimentales de los com- puestos, máxima de 20 μM. Para generar moléculas señuelo Se usó la herramienta A Database of useful Decoys: Enhanced (DUD-E) [21]. En la herramienta se ingresó el código SMILES y luego de una hora se obtuvieron los resultados. Del archivo recibido se extrajo las líneas que contenían los ligandos y se agrupó en un solo documento. Los señuelos fueron separados en grupos se cien y se dejó solo con su código SMILES y su código de identificación.

A) Acoplamiento para las moléculas señuelo

Preparación del ligando y receptor: Para la preparación del ligando se usó una metodología similar a la aplicada anteriormente, usando los códigos SMILES de cada molécula señuelo y de los ligandos. La única diferencia que se efectuó tras generar los fragmentos, fue que inicialmente se crearon 200 conformaciones y en un siguiente resul- tado se corrió el mismo programa, pero generando una única conformación. La adición de cargas solo se efectuó sobre los resultados que generaron una única conformación. De igual modo se mantuvo el receptor preparado previamente. Para el acoplamiento se usó el software FRED [19]. Partiendo de las 200 conformaciones generadas. Únicamente se guardó una pose. También se efectuó el acoplamiento usando una alta resolución. A los resultados obtenidos se le adicionaron cargas usando del Software Quacpac molcharge [18].

B)Re-scoring

Preparación del receptor, esferas y caja: Se usó el software Dock 6.9 [22] y se mantuvieron los parámetros pre-establecidos por el programa para la obtención del receptor, las esferas y la caja. Para realizar la puntuación se usaron las herramientas de DOCK 6.8, OEDOCKING y GOLD. Los parámetros de cada programa se mantuvieron en sus valores por defecto. Además, se calcularon quince funciones de puntuación (tabla I) para las poses obtenidas durante el acoplamiento molecular [23].

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ISSN 2697-3650REVISTA MINERVA DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA Vol. 1, Nº 1 Abril 2020 (pp. 13-23)

Fig 1. Mejores resultados obtenidos para EF evaluando el 1% de los datos.

En la figura 1 es Evidente que el mejor resultado se da usando el algoritmo CompsCore. Seguido del valor de GASPS el cual es reconocido por el algoritmo como la mejor puntuación individual en el 1% de los datos. El resulta- do de la mejor función puntuación y el mejor componente sugerido por el algoritmo se encuentran a continuación con resultados no muy altos en comparación con el resultado de CompScore. Está claro que el algoritmo efectiva- mente combino los componentes de puntuación para maximizar la métrica de enriquecimiento. Por otra parte, los datos de entrenamiento también maximizan el enriquecimiento de los activos usando

BEDROC con un valor de α=160.9. En este caso CompScore superó significativamente a las funciones y com- ponentes de puntuación arrojando un valor de BEDROC= 0,875. Siendo este valor más del doble del valor más alto obtenido entre los 15 componentes de puntuación comparados, cuyo valor fue de

BEDROC= 0,410. Aunque la función GPLP y los componentes GASPS y OEPLPNonpolar presenta valores altos en comparación a las demás (tabla II). No es relevante si se compara con los resultados de CompScore (figura 2).

Fig 2. Resultado de la métrica BEDROC.

En la figura 2 CompScore es claramente el mejor resultado. Mientras los otros componentes y funciones presentan valores similares entre sí, pero poco relevantes comparados con el resultado de Compsore. La similitud entre los resul- tados, que presentan las funciones y componentes de puntuación, sugiere que el componente GASPS puede lograr un rendimiento similar a la mejor función de puntuación completa GPLP. Este tipo de resultados es explicado por la meto- dología de CompScore. Según su hipótesis los componentes de las funciones de puntuación son de suma importancia e incluso pueden ser más relevantes que las funciones de puntuación completas.

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Fig 3.a Curvas completas AUAC de la metodología CompScore, de las funciones y componentes de puntua-

ción.3. B. curvas para el 10% de los datos

La validación externa se realizó siguiendo la metodología antes descrita con el 20% de ligandos y 20% de señue- los. De los resultados obtenidos anteriormente del algoritmo CompScore se efectuó la recalificación de los datos externos y se midió el enriquecimiento sobre los datos restaurados. Es por tal motivo que únicamente se analizaron las 15 funciones completas de puntuación y el algoritmo CompScore.

Para los datos de validación la metodología de CompScore presento un resultado para la métrica EF= 40,44 un valor muy alto en comparación con el mejor de los resultados de las funciones de puntuación completa GPL que obtuvo un valor EF= 20,22 (figura 4). Considerando que este mismo valor se obtuvo con la función completa GASP, se podría creer que ambas funciones de forma individual presentan un buen enriquecimiento. Sin embargo el re- sultado para la métrica de BEDROC y el AUAC es inferior (tabla 4). El único fenómeno que se podría considerar relevante es que la función completa GPLP del programa Gold, presenta resultados relevantes tanto para los datos de entrenamiento como de validación. En promedio las funciones de los programas Gold y OpenEye presentan un valor de EF=13,480 en ambos casos, mientras que las funciones del programa Dock 6.8 fueron inferiores, con un promedio EF=5,616. Por tanto, sería más recomendable usar estos programas para calcular la métrica EF, ya que presentan valores más altos de enriquecimiento para el 1% de los datos.

Fig 4. Resultados de EF usando la metodología CompScore en comparación con el mejor resultado de las

funciones completa de puntuación GPLP.

Para los resultados de BEDROC el programa Gold presento entre sus funciones completas en promedio un valor de 0,762 siendo este el valor más alto, seguido de las funciones de OpenEye que presento un valor de BE- DROC=0,231 y DOCK6.8 con el promedio más bajo 0,105 (tabla 4). Entre estos resultados, el puntaje más alto fue para la función PLP del programa Gold, con un valor de 0,386. Sin embargo, este valor es bajo si se compara con el de la metodología CompScore donde se obtuvo un valor de BEDROC=0,848 (Figura 5).

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Por otra parte, aunque la metodología CompScore proporciona un alto enriquecimiento para las métricas EF y BEDROC, no se evidencia una distinción clara entre compuestos con baja o nula estabilización. Esto se comprobó al buscar la posición en la que el algoritmo situó los compuestos de FRET menor a 10 grados. Muchos de ellos se encontraban en posiciones intermedias, mientras dos de ellas se encontraron entre los primeros 100 datos.

Es recomendable que la métrica EF sea enriquecida cuando se quiere evaluar la clasificación de los métodos en el cribado virtual. Dado que su principal propósito es clasificar al principio de una lista ordenada los compuestos activos (ligandos) en una fracción especifica. Mientras que BEDROC cumple la función de representar el enrique- cimiento temprano. Si se desea maximizar su valor es necesario proporcionar el parámetro α.

V.CONCLUSIONES

El uso de moléculas activas e inactivas permite un mejor resultado de acoplamiento para su posterior valida- ción. El uso de las herramientas de CompScore a partir de su algoritmo genético genera un aumento significativo en las métricas de enriquecimiento. El valor EF de 40,44 en los datos de validación es muy superior al obtenido en las funciones de puntuación individuales, lo mismo ocurre en los datos de entrenamiento. Esta característica demuestra que el modelo tiene una calidad superior en comparación a otros. Se ve enriquecidas ambas métricas EF y BEDROC. De forma menos evidente aumenta el valor de AUAC. La capacidad de enriquecimiento de EF considerando el 1% de las moléculas activas es más acertada que considerar fracciones de 5% 10% o 20% ya que las funciones de puntuación generaron una lista ordenada de compuestos activos en orden ascendente. En conclusión la estrategia de VS mostro características relevantes de enriquecimiento y capacidades adecuadas para el recono- cimiento temprano. Sin embargo también es evidente que el modelo no distingue entre compuestos con buena o mala estabilización.

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